普欣生物是一家专注于重组蛋白研发、生产、并可为客户提供重组蛋白订制服务的高新技术企业。
一、蛋白如何定量的?
通常采用BCA、Bradford和OD280三种方法来定量。
二、为什么用我的定量方法测出来的结果与普欣标签上的定量不符?
采用不同的蛋白定量方法,会有不同的结果。有时候定量方法不同造成的结果差异很显著。每个检测方法都有其局限性,针对不同的蛋白,需要选择其合适的检测方法。另外,样品的稀释过程,涉及稀释方式,如高浓度直接稀释到低浓度(mg-ug-ng)会比10倍梯度稀释存在更大误差;而使用的耗材如非低吸附类(枪头、可立管等),也可能造成样品浓度偏差;由于稀释过程中会引入很多不确定因素,所以我们不建议对微量蛋白进行定量。
三、我购买了小包装冻干蛋白质,为什么收到货后只有一只空管?
与市场上的有些蛋白产品不同,本公司绝大部分的产品中不含载体蛋白或其他添加物(如牛血清白蛋白(BSA),人血清白蛋白 (HSA)和海藻糖等),并且以最低含盐量的溶液冻干。因此,微量的蛋白在冻干过程中沉积在管内,形成很薄或几乎看不见的蛋白层,甚至蛋白粉末还可能飘悬在管壁上。打开管盖前,我们建议使用离心机快速离心20-30秒,使附着在管盖或管壁的蛋白粉末聚集到管底。
一、如何重溶(Reconstitute)冻干粉蛋白?
除非说明书上有更具体的说明,我们建议采用以下方式:
(1)将试剂瓶和重溶缓冲液平衡至室温。
(2)短暂离心试剂瓶以确保在小瓶底部收集所有冻干物。
(3)加入推荐的重溶缓冲液,达到产品说明上推荐的浓度。避免剧烈振荡或移液器吹打,这可能导致蛋白质变性。
(4)使试剂瓶在室温下重溶15-30分钟,可使用360度摇床或手动轻轻上下颠倒。
(5)每管体积不小于10μL分装,并按产品说明书上的指示储存。
(6)如果小瓶内呈现薄片或颗粒,则在室温下将产品混合几小时,然后在4℃过夜。
二、贵司的蛋白产品重溶浓度是多少?
您可参考产品页面“Reconstitution”部分。例如:产品cat#105-02,此产品提供的是冻干粉形式,建议重溶浓度为:在无菌蒸馏水或无菌含0.1 % BSA水溶液中重溶至0.1-1.0 mg/mL。另外我司通常推荐质量较高的BSA(高纯度,低内毒素,低脂肪酸和可用作细胞培养)。短期内使用,可以直接用无菌水溶解,如果需要分装冻存,建议加入0.1 % BSA,以避免蛋白发生降解。另外,我司亦提供部分高浓度产品,例如:cat#105-02G,此产品提供的是冻干粉形式,建议重溶浓度为:在无菌蒸馏水或无菌含0.1 % BSA水溶液中重溶至0.1-5.0 mg/mL。
一、如何确定蛋白活性实验参考用量?
凡经过生物活性验证的蛋白产品,在我司产品页面均有活性验证信息,客户可在生物活性(Biological Activity)一栏中查看使用的细胞类型,ED50值等信息。对于不同的蛋白产品,活性检测的方法不同。同一种蛋白产品,在不同的细胞上检测,所用的方法也是不同的。最终得到的ED50值也不同。在没有文献依据和参考用量的情况下,初次使用某种蛋白,建议您尝试浓度梯度。
二、为何ED50是一个范围?
生物活性实验是对蛋白质的生物学反应的一种测量。因此,生物活性实验中的任何变化也可能导致不同的结果。这种变化可能包括细胞密度,细胞年龄,传代数,营养状况,培养基和所用的添加剂,以及实验操作者的操作手法。由于生物活性实验的可变性,同一蛋白质在不同情况下可能不会产生相同的ED50。因此普欣的蛋白质说明书上给出ED50的范围。
三、贵司的蛋白活性是怎么测出的?
我司已经过活性验证的蛋白产品,通常会在产品页面技术参数中列出“Biological Activity”,例如:产品cat# GMP-606-09,在“Biological Activity”部分显示“活性测定为当用作细胞培养的基质时,其支持细胞附着和扩散的能力:在这个应用中,能够达到这种效果的推荐浓度通常是1-5 μg/cm²。纤维连接蛋白也可添加至培养基中促进细胞扩散,推荐浓度为0.5 ~ 50 μg/mL。
四、以ED50或units/mg标示比活性(specific activity),两者之间有什么关联,怎么换算?
半数有效浓度ED50的定义是可诱导50%最大反应的细胞因子浓度,这种活性表示法仅适用于剂量反应曲线呈S形的细胞因子。将ED50 (ng/ml)转化为比活性(units/mg)的公式为:
五、蛋白质干粉重溶时,说明书中提到用酸来溶解,会不会对蛋白质活性造成影响?用作细胞实验时,会伤害细胞吗?
蛋白质使用说明书上推荐的溶解方法,会得到最好的溶解效果,保证蛋白质活性复原最完全。在您使用过程中,此原液被稀释成工作液后,微量的酸不会对您的实验有影响。
一、产品如何保存?
因为产品性质不同,请仔细阅读说明书,并根据说明书描述方法,妥善存储。
一、GMP蛋白与传统蛋白的区别是什么?
通常,GMP蛋白和传统蛋白的序列、表达系统是相同的。PrimeGene®的GMP蛋白根据ICH-Q7a Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical ingredients 文件的相关部分制作,具有以下优点:1. 详实的产品相关信息;2. 严格的质量管理体系;3. 批次间稳定性高;4. 无外源动物源性;5. 按客户需求,可按需提供相关法规支持文件;6. 生产设备和生产环境符合相关法规要求,符合GMP指导原则;7. 产品进行无菌检测、无支原体,HCP检测;8. 生产设备工艺及测试方法,均经过验证;9. 原材料测试及供应商资质审查;10. 完善的材料审查流程和文档化管理,生产人员资质符合法规要求。
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